De oxidastest Det är en diagnostisk metod som visar närvaron av enzymkomplexet som kallas cytokromoxidas c. Detta system inducerar transformation av cytokrom reducerat till oxiderat, eftersom det fångar syre och detta i sin tur fungerar som den sista elektronacceptorn (H+) i andningskedjan.
Termen oxidas är ett kortfattat sätt att hänvisa till enzymet cytokromoxidas, även känt som indofenoloxidas. I antiken trodde man att enzymerna cytokromoxidas och indofenoloxidas var två olika enzymer, men idag är de kända för att vara desamma.
För sin del är cytokromer hemoproteiner som innehåller järn och kompletterar cytokromoxidasystemet. Cytokromer kan variera från art till art.
Det finns olika varianter av cytokromer (cytokromer a1, a2, a3 och 0). Vissa bakterier kan bara producera en, men andra upp till två eller tre åt gången. I denna mening är närvaron av cytokrom a och a3 känd som cytokromoxidas c. Detta är den typ av cytokrom som oxidastestet upptäcker..
Släktena Neisseria och Pseudomonas innehåller cytokromoxidas c. Dessa släktingar ger det positiva oxidastestet och hjälper till att skilja dem från släktena Acinetobacter respektive Stenotrophomonas..
Det finns också andra släkter som är oxidas-positiva.
Artikelindex
Cytokromoxidas c-systemet fungerar enligt följande: oxidaspositiva mikroorganismer använder syre för att generera energi genom aerob andning. Detta system fungerar tack vare transport av elektroner från givarämnen som NADH+ mot receptorsubstanser, i detta fall syre.
Detta resulterar i produktion av energi (ATP) och vatten eller väteperoxid, beroende på det cytokromoxidasystem som mikroorganismen har..
Det är därför som de flesta oxidaspositiva bakterier också är katalaspositiva, ett nödvändigt tillstånd för att eliminera den producerade väteperoxiden, eftersom detta ämne är giftigt för bakterier..
Cytokromoxidas-c-systemet finns i vissa aeroba bakterier, vissa fakultativa anaerober, få mikroaerofila och inga strikta anaerober. Det senare är förståeligt, eftersom strikta anaerober inte kan leva i närvaro av syre, därför saknar de cytokromoxidasystemet..
I detta test använder den ämnen som fungerar som artificiella elektronacceptorer och ersätter naturliga ämnen inom elektrontransportkedjan..
Huvudsakligen färgämnen som parafenylendiamin och indofenol används, som fungerar som receptorsubstrat och artificiella elektrondonatorer.
Parafenylendiamin oxideras av cytokromoxidas c-systemet. Färgämnet i sin reducerade form är färglöst, men i sin oxiderade form är det färgat.
Således framgår närvaron av cytokromoxidas-c-systemet; eftersom en positiv reaktion kommer att generera en lavendel eller blå-lila färg beroende på vilket reagens som används.
Å andra sidan, om det sista elektronacceptabla ämnet i andningskedjan skiljer sig från syre, kommer oxidastestet att vara negativt (det finns ingen färgproduktion); detta är fallet med anaeroba mikroorganismer.
På samma sätt, om cytokromet som används av mikroorganismen skiljer sig från cytokromoxidas c, kommer det också att ge det negativa testet..
Det finns olika reagens och protokoll för oxidastestet, alla för samma ändamål..
Kovacs-reagens, Gordon- och McLeod-reagens, Nadi-reagens, Snickare, Suhrland och Morrison-reagens och användning av oxidasskivor.
Den består av 1% tetrametyl-p-fenylendiamindihydroklorid.
Kovacs-reagenset framställs genom att lösa 1 g av den ovannämnda substansen i 50 ml destillerat vatten. Det värms subtilt tills det är helt upplöst. Överför till en gul flaska med tillräcklig kapacitet och fyll upp volymen till 100 ml med destillerat vatten. Vänta minst 15 minuter innan du använder den. Förvaras i kylskåp skyddad från ljus.
Det är märkt Kovacs oxidasreagens för att skilja det från det Kovacs-reagens som används för att avslöja indoltestet. Detta reagens är det mest känsliga, mindre giftiga men dyrare än resten av reagensen.
En positiv reaktion kommer att bevisas med detta reagens med kolonifärgskiftet till lavendel, som snabbt blir lila nästan svart. En negativ reaktion är uppenbar eftersom det inte finns någon färgförändring i kolonin eller det får en liten rosa färg. Mediet kan också mörkna, men det betyder inte en positiv reaktion.
Med detta reagens är reaktionstiden avgörande, en färgförändring som inträffar mellan 5 och 15 sekunder anses vara en positiv reaktion..
Den består av dimetyl-p-fenylendiamindihydroklorid, även känd som N-dimetyl-p-fenylendiamin eller p-aminodimetylanilinmonohydroklorid. Den framställs enligt beskrivningen för Kovacs oxidasreagens och ersätter den berörda substansen..
Detta reagens är något mer stabilt än Kovacs oxidasreagens, även om alla reagens som innehåller p-fenylendiamin är instabila..
Denna reaktion tolkas senare, den tolkas som positiv med utseendet på en blå-lila färg inom 10 till 30 minuter..
Den består av 1% a-naftol i etylalkohol (95% etanol) och 1% aminodimetylanilin. Blandningen bereds i lika delar och använder absolut etylalkohol som utspädningsmedel tills den tillräckliga mängden för 100 ml har fullbordats.
Den består av 1% p-aminodimetylalaninoxalat. Förbered på samma sätt som beskrivs för Kovacs oxidasreagens, byt ut för motsvarande substans.
Med lösningen klar, förbereda testremsor enligt följande: 6-8 cm Whatman nr 1 filterpappersremsor impregneras med 1% dimetyl-p-fenylendiaminoxalatreagens.
De får torka utan kontakt med metall, förvaras i skruvkorkade burkar med torkmedel och förvaras i kylskåp. Dessa remsor är stabila i upp till 6 månader.
Det är det mest stabila reagenset av alla nämnda och kan hålla i upp till 6 månader i lösning. En annan poäng är att den inte färgar mediet runt kolonin, om det används direkt på tallriken.
Utseendet på en röd färg tolkas som ett positivt test.
De är kommersiella skivor som är impregnerade med reagens för oxidastestet. Det finns flera kommersiella märken på marknaden.
Dess användning är ganska praktisk, eftersom det inte är nödvändigt att bereda färska reagenser, vilket underlättar arbetet. De erhållna resultaten är tillförlitliga så länge skivorna är korrekt bevarade.
Direkt plattmetod, indirekt metod på papper och användning av skivor impregnerade med oxidasreagens.
2 eller 3 droppar av något av de ovannämnda reagensen tillsätts för detta ändamål direkt på kolonin (erna) som finns i en platta med odlingsmedium som inte innehåller glukos..
Koloniernas färgförändring eller inte tolkas, inte medium. Den giltiga reaktionstiden beror på vilket reagens som används.
Klipp en bit filterpapper (Whatman nr 1) till en storlek på 6 cmtvå och placeras i en tom petriskål.
Tillsätt 2 eller 3 droppar Kovacs oxidasreagens på papperet, ta en del av kolonin som ska studeras med ett platinahandtag eller en tandpetare av trä och sprid den i en rak linje på det reagensimpregnerade papperet. Utför inom 5-10 sekunder.
Med remsorna beredda med Carpenter, Suhrland och Morrison-reagens sprids en koloni på den torra remsan. En enda remsa används för att testa flera stammar. Tolk på 10 sek.
Fukta kommersiellt skivorna subtilt med sterilt destillerat vatten och lägg ovanpå kolonin som ska studeras. Det rekommenderas att använda plattorna vid 35 ° C. Om plattor vid rumstemperatur eller kylplattor används är reaktionen lite långsammare. Tolk färgförändringen mellan 10 och 20 sekunder.
Kolonier som finns i blod eller chokladagar kan användas.
Fukta skivan enligt beskrivningen tidigare. Lägg den i en tom petriskål. Ta en tillräcklig mängd av kolonin för att studera med ett platinahandtag eller en tandpetare av trä och placera på skivan. Tolk färgförändringen mellan 10 och 20 sekunder.
Släktet Neisseria och Acinetobacter är ibland väldigt lika morfologiskt, för även om släktet Acinetobacter är en gramnegativ stav, kan det ibland ta en coccoidform och fördelas i par, simulera släktet Neisseria..
I det här fallet är oxidastestet verkligen användbart. Släktet Neisseria är positivt och Acinetobacter negativt.
Men släktet Moraxella är mycket likt släktet Neisseria och båda ger en positiv reaktion; det är därför som kolhydratfermenteringstester alltid måste utföras för definitiv identifiering.
Å andra sidan är oxidastestet användbart för att skilja en bakterie som tillhör Enterobacteriaceae-familjen (alla oxidasnegativa) från andra fermentorer, såsom släktet Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas (oxidaspositivt).
Släktet Vibrio och Helicobacter är också oxidaspositiva.
Använd kända stammar av Escherichia coli som en negativ kontroll och stammar av Pseudomonas aeruginosa som en positiv kontroll.
-Reagenserna måste användas nylagade, deras hållbarhet i lösning vid rumstemperatur är kort eftersom de är mycket instabila. Kylda kan de vara mellan 5 dagar och 2 veckor.
-Reagenserna är färglösa, om de byter färg måste de kasseras. Skadade skivor är uppenbara eftersom de mörknar över tiden.
-En positiv reaktion med Kovacs oxidasreagens mellan 15-60 sek anses vara en fördröjd reaktion och efter 60 sekunder bör den betraktas som negativ.
-De Haemophylus influenzae ger en negativ oxidasreaktion om något reagens med dimetyl-p-fenylendiamin används, men positivt om Kovacs oxidasreagens (tetrametyl-p-fenylendiamin) används.
-Media som innehåller glukos stör testet och ger falska negativ.
-Stammar av Bordetella pertussis kan ge en falskt positiv reaktion om de kommer från högkoncentrerade blodagarplattor.
-Användningen av metallhandtag (järn) ger en falsk positiv reaktion.
-Eftersom reagensen är mycket instabila och tenderar att självoxideras, rekommenderas att frysa portioner på 1 till 2 ml och ta bort efter behov..
-Ett annat sätt att fördröja den automatiska oxidationen av reagenset är att tillsätta 0,1% askorbinsyra vid beredning av reagensen..
-Eftersom reagenserna är instabila rekommenderas en kvalitetskontroll varje vecka..
-Reagens som inte uppfyller kvalitetskontrolltestet ska inte användas..
Ingen har kommenterat den här artikeln än.