De Voges-Proskauer test är ett biokemiskt test som används för att identifiera bakterier som tillhör Enterobacteriaceae-familjen. Det är särskilt användbart för att skilja stammar av Escherichia coli från Klebsiella och Enterobacter, bland annat.
Testet utförs i ett flytande odlingsmedium som heter Methyl Red-Voges Proskauer, bättre känt av akronymen RM / VP. Detta medium består av buffrad polypepton, glukos, dikaliumfosfat och destillerat vatten..
Det nuvarande RM / VP-mediet är en modifiering av Clark and Lubs-mediet, som ursprungligen innehöll en lägre koncentration av peptoner och glukos. Därför producerades mindre av vätejonen, som krävs för den positiva Voges-Proskauer-reaktionen..
Testet baseras på mikroorganismens förmåga att använda glukos genom butylenglykolvägen och bilda en neutral slutprodukt som kallas acetoin, i närvaro av syre och ett alkaliskt pH.
I RM / VP-mediet, förutom att kunna avslöja Voges-Proskauer-testet, kan det metylröda testet också avslöjas.
Artikelindex
Pluripeptonerna som finns i mediet ger de väsentliga näringskraven för bakterietillväxt. För sin del är glukos huvudföreningen. Många bakterier har förmågan att metabolisera glukos och bilda pyruvinsyra.
Pyruvinsyra är en mittpunkt i glukosmetabolismen och därifrån kan varje mikroorganism ta olika vägar. Vissa kommer att bilda blandade syror, såsom mjölksyra, ättiksyra, myrsyra och bärnstenssyra, och andra kommer att bilda neutrala produkter som 2,3-butandiol..
Voges-Proskauer-testet avslöjar mikroorganismens förmåga att bilda acetylmetylkarbinol (acetoin), en mellanprodukt av 2,3-butandiol under aeroba förhållanden.
Acetoin reduceras och bildar 2,3-butandiol, men denna reaktion är reversibel, så om 2,3-butandiol oxideras bildas acetoin. Därför är syre viktigt.
Dikaliumfosfat är bufferten som buffrar blandningen till pH 6,9 ± 0,2.
För att visa reaktionen måste en utveckling utföras med två reagenser (Barritreagens), kända som Voges A och Voges B.
Voges A är en 5% lösning av a-naftol och Voges B är en 40% kaliumhydroxidberedning. Om kaliumhydroxid inte är tillgängligt kan det ersättas med 40% natriumhydroxid.
Α-Naftol är en katalysator som ökar reaktionens färgintensitet, vilket gör testet mer känsligt. Α-naftolen måste alltid tillsättas först, skaka röret så att mediet kommer i kontakt med syret. På detta sätt oxideras den närvarande acetoinen till diacetyl och 2,3-butandiol oxideras för att bilda acetoin och överför detta till diacetyl..
Detta är hur α-naftol kommer att binda till diacetyl, som i sin tur har sammanfogat guanidinkärnan i aminosyran arginin, den senare kommer från pluripeptoner.
För sin del är kalium- eller natriumhydroxid ansvarig för att absorbera COtvå och att reagera med peptoner. Denna reaktion orsakar bildandet av en laxrosa färg, tydligt synlig efter att skaka röret mycket bra..
Rätt mängder av diacetyl, pepton och α-naftol måste blandas för att färg ska uppstå direkt. Om detta inte händer får röret vila i 15 minuter innan det tolkas..
Vanligtvis är testet positivt efter 2 till 5 minuter, när en svag rosa färg kan ses. Om du får vila i 30 minuter till 1 timme blir färgens intensitet maximal (intensiv röd).
Ett negativt test visas när buljongen blir gul. Om testet är negativt efter en timme kan en kopparfärg bildas som ett resultat av reaktionen av kaliumhydroxid på α-naftol.
Väg 17 g av det uttorkade odlingsmediet och lös upp i en liter destillerat vatten. Låt stå i 5 minuter. Värm upp till koka för att lösa upp helt. Servera 3 till 4 ml i rör och sterilisera i autoklav vid 121 ° C i 15 minuter.
Det uttorkade odlingsmediet är beige till färgen och det beredda mediet är ljusgult..
Det slutliga pH-värdet för mediet är 6,9 ± 0,2.
Väg ut 5 g a-naftol och lös upp i 50 ml etylalkohol (absolut). Fortsätt sedan tillsätta etylalkohol tills den når 100 ml..
Väg 40 g kaliumhydroxid och lös upp i 50 ml destillerat vatten i en bägare. Glaset måste placeras i ett kallvattenbad för att kontrollera temperaturen, för när beredningen är upplöst stiger temperaturen kraftigt.
Efter att lösningen är kall överförs den till en mätkolv och fylls på till 100 ml med destillerat vatten..
För att utföra Voges-Proskauer-testet ympas en RM / VP-buljong med den mikroorganism som studeras, från en ren odling i 18 till 24 timmar..
Inokulatet borde inte vara så tätt. Det inkuberas vid 35-37 ° C under 24 till 48 timmar, även om inkubering i flera dagar ibland är nödvändig. Cowan och Steel tror att 5 dagar är den minsta inkubationstid som krävs för att upptäcka alla positiva Voges-Proskauer (VP) arter av Enterobacteriaceae-familjen..
Separera en 1 ml alikvot i ett rör och utveckla enligt följande: Placera 12 droppar (0,6 ml) Voges A-reagens och 4 droppar (0,2 ml) Voges B. Blanda för att lufta och låt sätta sig i 5-10 minuter innan du tolkar. Men om testet fortfarande är negativt, låt det sitta och observera röret efter 30 minuter till 1 timme..
Utseendet på en rosa-röd färg indikerar att Voges-Proskauer-reaktionen är positiv. Om mediet förblir gult är reaktionen negativ.
Att lägga till utvecklare i den angivna ordningen och kvantiteten är viktigt för att undvika falska negativ..
Voges-Proskauer-testet är användbart för att skilja mellan stammar av E coli som är VP-negativa, bland släktena Klebsiella, Enterobacter, Serratia, som är VP-positiva.
Kontrollstammar kan användas för att testa kvaliteten på det beredda mediet, inklusive Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium och Enterobacter cloacae ATCC 13047.
Förväntade resultat är positiva Voges-Proskauer-reaktioner endast för K. pneumoniae Y E. cloacae. Resten ger negativa reaktioner.
Ingen har kommenterat den här artikeln än.