De Löwenstein-Jensen medium är ett selektivt fast medium för isolering och utveckling av bakterier av släktet Mycobacterium, såsom Mycobacterium tuberculosis, M. avium, bland annat, med undantag för lepraearten, som inte är odlingsbar.
Bakterier av släktet Mycobacterium växer inte i konventionella odlingsmedier, därför var det nödvändigt att utforma ett speciellt medium för deras isolering. Originalmediet skapades av Löwenstein och modifierades senare av Jensen.
Modifieringen bestod i att Kongo-rött färgämne eliminerades och ersatte det med en högre koncentration av malakitgrönt. Det förändrade också koncentrationerna av magnesiumcitrat och monokaliumfosfat.
Löwenstein-Jensen-medium innehåller för närvarande potatisstärkelse, asparagin, magnesiumcitrat, monokaliumfosfat, magnesiumsulfat, malakitgrön, nalidixinsyra, cykloheximid, lincomycin, vispade ägg, glycerin och vatten..
Mykobakterier isoleras normalt från platser som inte är sterila, såsom sputum, urin, abscesser, bland andra. Detta innebär att de flesta proverna kommer att innehålla den vanliga mikrobiota i området, plus patogenen..
Det är därför Löwenstein-Jensen-mediet innehåller en serie hämmare i sin sammansättning representerad av malakitgrönt, antibiotika och svampdödande medel..
Dessutom måste prover som kommer från icke-sterila platser saneras och neutraliseras innan de såddas på Löwenstein-Jensen-medium.
Artikelindex
Närvaron av ägg och glycerin i Löwenstein-Jensen-mediet stimulerar tillväxten av mykobakterier eftersom de ger de fettsyror och proteiner som är nödvändiga för utvecklingen av dessa mikroorganismer..
Löwenstein-Jensen-medium innehåller malakitgrönt, vilket är en hämmare av medföljande mikrobiota. Men den innehåller också nalidixinsyra (35 µg / ml), som hämmar gramnegativ mikrobiota, cykloheximid (400 µg / ml), som hämmar saprofytisk svamp och jäst, och lincomycin (2 µ / ml), som hämmar grampositiv mikrobiota.
Vissa kommersiella företag föredrar att lägga till följande kombination av antibiotika: polymyxin B 200 000 enheter / L, amfotericin B 10 mg / L, karbenicillin 50 mg / L och trimetoprim 10 mg / L.
Detta medium innehåller inte agar, därför uppstår stelningen av mediet på grund av koaguleringen av albuminet som finns i ägget under sterilisering..
Väg 37,3 g av det uttorkade mediet i 600 ml destillerat vatten till vilket 12 ml glycerol tidigare har tillsatts. Blandningen upphettas under omrörning ofta tills den är helt upplöst. Autoklaver mediet vid 121 ° C i 15 minuter.
Å andra sidan bör en homogen suspension av 1000 ml färska ägg beredas under aseptiska förhållanden. Tillsätt äggsuspensionen till 600 ml av det beredda mediet vid en temperatur av 50 - 60 ° C, och undvik luftbubblor.
Antibiotiska lösningar tillsätts också efter autoklavering..
Häll mediet i sterila provrör med skruvlock. Värm rören vid 85 ° C i 45 minuter i lutande läge..
Färgen på det beredda mediet är akvamaringrönt och kan uppvisa vita fläckar på grund av närvaron av ägglipider..
Mediets pH måste vara 7,2 ± 0,2
Förvara rören i kylskåp och skyddas från direkt ljus tills de används. Temperera innan sådd.
Det finns en modifiering av mediet som kallas "Gruft modification of the Löwenstein Jensen". Denna innehåller samma föreningar som det klassiska mediet men RNA-5 mg / 100 ml tillsätts, och som hämmare innehåller den malakitgrön 0,025 g / 100 ml, penicillin 50 U / ml och nalidixinsyra 35 ug / ml..
Löwenstein-Jensen-medium används för isolering av mykobakterier från olika typer av prover. En Ziehl-Neelsen-fläck rekommenderas för varje prov där det finns misstänkt förekomst av mykobakterier..
Vissa prover kommer från sterila platser men andra inte. Icke-sterila prover måste dekontamineras efter behov:
Sputumprover ska dekontamineras enligt följande: bestäm mängden sputumprov i ml och tillsätt samma mängd 4% NaOH till provet och inkubera vid 37 ° C.
Skaka blandningen ofta under en 30-minutersperiod. Därefter centrifugeras vid 3000 varv / min i 30 minuter.
Kasta supernatanten över en fenolisk desinfektionsmedel. Använd sedimentet för sådd, men först måste pH neutraliseras.
För att neutralisera sedimentet, HtvåSW4 5% i närvaro av den fenolröda indikatorn tills den når ett neutralt pH som ger en laxfärg.
I detta fall måste provet centrifugeras vid 3000 varv / min i 30 minuter. Supernatanten kasseras och pelleten används. För att dekontaminera sedimentet tillsätt 3 ml 4% NaOH och rör om ofta vid 37 ° C under en halvtimme..
Centrifugera igen, supernatanten kasseras och pelleten används. Det senare måste neutraliseras enligt förklaringen i slemprovet..
Låt provet sätta sig i kylen i 24 timmar. Separera supernatanten. Den återstående pelleten bör centrifugeras i 30 minuter vid 3000 RMP. Kassera supernatanten igen och bered pelleten med 3 ml steril fysiologisk lösning..
Tillsätt 3 ml 4% NaOH och fortsätt till sanering och neutralisering som beskrivits tidigare..
I denna typ av prov centrifugeras den och supernatanten kasseras. Utför ett gram på sedimentet eller observera det direkt under mikroskopet; Om inga bakterier observeras är dekontamineringssteget inte nödvändigt, inte heller neutraliseringssteget.
I detta fall kan provet sås direkt med sedimentet. Om det finns bakterier, fortsätt att sanera och neutralisera enligt beskrivningen ovan..
Till denna typ av prov måste 5 ml destillerat vatten tillsättas för senare centrifugering vid 1500 varv per minut i 10 minuter. Kassera supernatanten och centrifugera pelleten på nytt vid 3500 rpm i 30 minuter. Använd sedimentet för att så odlingsmediet.
Pinnen ska placeras i ett sterilt rör som innehåller lika delar destillerat vatten och 4% NaOH. Pinnen måste pressas mot rörets väggar så att provet späds ut i vätskan. Centrifugera och använd sedimentet. Neutralisera sedimentet som redan beskrivits.
Löwenstein-Jensen-mediet ympas genom att tillsätta 0,5 ml av provet på ytan av mediet. Rotera röret för att fördela provet genom mediet. Använd inte platinahandtag.
Ett andra rör kan ympas innehållande Stonebrink-medium för att isolera Mycobacterium bovis och andra arter som inte växer i Löwenstein-Jensen-mediet.
De ympade rören inkuberas aerobt vid 37 ° C, med locket något löst och lutar vid ungefär 5 ° och skyddas från ljus. Miljön kan berikas med 5-10% koldioxid. Kontrollera kulturer två gånger i veckan tills kolonier uppträder.
När provet har absorberats dras locken åt. Den maximala inkubationstiden är 8 veckor, om det efter denna tid inte finns någon tillväxt, rapporteras den som negativ.
Följande stammar kan användas som kvalitetskontroll:
Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Cryptococcus neoformans ATCC 32045
Utmärkt utveckling förväntas för de tre första nämnda arterna, för M. fortuitum tillväxten måste vara bra, samtidigt som M. bovis liten eller ingen tillväxt förväntas. Andra arter än släktet Mycobacterium måste hämmas helt.
Det beredda mediet måste skyddas från ljus, långvarig exponering för ljus får mediet att växa från grönt till blått, i detta fall kan mediet inte längre användas. Detta beror på att malakitgrönt är ljuskänsligt..
Mediet, eftersom det innehåller ägg, kan lätt förorenas om det inte hanteras aseptiskt. Kan lösas om den är förorenad med proteolytiska bakterier.
Odling och hantering av bakterier av släktet Mycobacterium kräver kvalificerad personal som är medveten om de biosäkerhetsåtgärder som måste följas för att undvika att förorenas eller förorena andra..
HCl bör inte användas i neutraliseringssteget på grund av bildandet av natriumklorid, som kan vara giftigt för Kochs bacillus..
Proverna bör förvaras i kylskåp och skyddas från ljus medan de inte bearbetas..
Ingen har kommenterat den här artikeln än.