De Rekombinant DNA (RDNA eller rDNA) är en artificiell nukleinsyramolekyl skapad i laboratoriet genom att integrera segment av intresse från två organismer. Det är också känt som chimärt DNA tack vare dess hybridegenskap. Denna typ av DNA finns inte i naturen.
Den grundläggande metoden för att generera den inkluderar: (a) valet av ett mål-DNA och dess införande i ett annat DNA-fragment (vanligtvis en bakteriell plasmid); (b) introduktion av denna plasmid i en bakterie, (c) selektion av bakterierna med hjälp av antibiotika och slutligen (d) expression av genen.
Tekniken utnyttjar en uppsättning enzymer som gör det möjligt att kopiera och klistra in specifika DNA-fragment enligt forskarens bedömning..
Målet med rekombinant teknik är i de flesta fall uttrycket av ett protein (känt som ett rekombinant protein) önskat av molekylärbiologen för framtida forskning eller att skapa ett protein av kommersiellt och terapeutiskt värde - såsom humant insulin, till exempel.
Artikelindex
Alla organiska varelser som vi känner har flera egenskaper. En av dessa är arten av det genetiska materialet och det sätt på vilket proteiner produceras - en process som kallas molekylärbiologins centrala "dogm"..
Med undantag för ett par virus lagrar alla organismer genetisk information i DNA (deoxiribonukleinsyra), samlad på ett mycket kompakt och organiserat sätt i cellens kärna..
För genuttryck transkriberas DNA-molekylen till budbärar-RNA, och den senare översätts till aminosyrans språk, proteinernas byggstenar..
Mellan 70- och 80-talet började molekylärbiologer dra nytta av de processer som naturligt förekommer inuti cellen och kunde extrapolera dem till laboratoriet.
På detta sätt kan en gen av animaliskt ursprung (t.ex. ett ryggradsdjur) införas i ett DNA-segment från en bakterie; eller DNA från en bakterie kan kombineras med ett viralt DNA. Således kan vi definiera ett rekombinant DNA som en molekyl som består av DNA från två olika organismer..
När denna hybrid- eller rekombinanta molekyl väl har skapats uttrycks genen av intresse. Med ordet uttryck vi vill hänvisa till processen för översättning till protein.
Ett viktigt inslag i utvecklingen av rekombinant DNA-teknik var upptäckten av restriktionsenzymer..
Dessa är proteinmolekyler som uppvisar förmågan att klyva DNA (nukleaser) i specifika sekvenser, som fungerar som "molekylära saxar". De fragment som genereras av dessa enzymer kallas restriktionsfragment.
Nämnda enzymer kan producera symmetriska snitt i målsekvensen (i båda kedjorna i samma höjd) eller asymmetriska snitt. En viktig aspekt av inverkan av restriktionsenzymer är att efter klyvning av kedjorna erhålls en "lös kant", komplementär till den andra kanten som skärs av samma enzym..
Några exempel är ECOR 1 och Sma 1. För närvarande är mer än 200 typer av restriktionsenzymer kända och kommersiellt tillgängliga..
För att vara användbar måste en sax åtföljas av limet. Denna förseglingsverkan av DNA (tidigare behandlad med restriktionsenzymer) utförs av ligaser.
Nedan kommer vi att beskriva de viktigaste stegen som rekombinant DNA-teknik kräver. Alla utförs av proffs i ett molekylärbiologilaboratorium.
Innan vi fortsätter med det experimentella protokollet måste vi notera att termen "klon" och verbet "klon" används i molekylärbiologi och bioteknik. Detta kan leda till förvirring.
I detta sammanhang hänvisar vi inte till kloning av allt en organism (som i fallet med den berömda fåren Dolly, till exempel), men till kloning av ett DNA-fragment, som kan vara en gen. Det vill säga, producera många kopior - genetiskt identiska - av sekvensen.
Det första steget är att bestämma vilken sekvens du vill använda. Detta beror helt på forskaren och målen för hans arbete. Detta DNA måste sedan isoleras och renas. Metoderna och förfarandena för att uppnå detta beror i sin tur på kroppen och vävnaden.
I allmänhet tas en bit vävnad och utsätts för behandling i en lysbuffert med proteinas K (ett proteolytiskt enzym) och därefter extraheras DNA. Därefter fragmenteras det genetiska materialet i små fragment.
Efter de förberedande stegen försöker forskaren introducera DNA-segmentet av intresse i en kloningsvektor. Från och med nu kommer vi att kalla detta segment av DNA för vit DNA.
En av de mest använda vektorerna i en plasmid av bakteriellt ursprung. En plasmid är en dubbelsträngad, cirkulär DNA-molekyl som finns naturligt i bakterier. De är främmande för bakteriekromosomen - det vill säga de är extrakromosomala och finns naturligt i dessa prokaryoter.
De grundläggande elementen i en vektor är: (a) ett replikationsursprung som möjliggör DNA-syntes; (b) selektionsmedel, vilket gör det möjligt att identifiera de organismer som bär plasmiden med mål-DNA, såsom resistens mot något antibiotikum; och (c) multikloningställe, där sekvenser som kommer att kännas igen av restriktionsenzymerna finns..
Det första framgångsrika rekombinanta DNA: t i laboratoriet klonades in i plasmiden pSC101 från bakterien E coli. Den innehåller ett restriktionsställe för restriktionsenzymet EcoRI och en antibiotikaresistensgen, förutom replikationsursprunget..
Insättningen av mål-DNA i plasmiden utförs med användning av de molekylära verktygen för restriktionsenzymer och ligaser beskrivna i föregående avsnitt..
Förutom plasmider kan DNA införas i en annan vektor, såsom bakteriofag lambda, kosmider, YAC (artificiella jästkromosomer), BAC (bakteriella artificiella kromosomer) och fagmider..
När den rekombinanta DNA-molekylen (gen av intresse i plasmiden eller någon annan vektor) har uppnåtts införs den i en värd- eller värdorganism, som kan vara en bakterie..
För att införa främmande DNA i en bakterie används en teknik som kallas bakterietransformation, där organismen utsätts för en behandling med tvåvärda katjoner som gör den mottaglig för DNA-upptag..
Metodiskt kan vi inte garantera att 100% av bakterierna i vår kultur effektivt har tagit upp vår rekombinanta DNA-molekyl. Det är här den del av plasmiden som innehåller antibiotikaresistens kommer till spel..
Således kommer de bakterier som har tagit upp plasmiden att vara resistenta mot ett visst antibiotikum. För att välja dem kommer det att räcka att applicera nämnda antibiotika och ta de överlevande.
Efter att ha valt bakterierna med vårt rekombinanta DNA fortsätter vi att använda värdens enzymatiska maskiner för att generera den proteinprodukt som är av intresse. När bakterierna reproducerar överförs plasmiden till deras avkomma, så den går inte förlorad under delningen..
Denna procedur använder bakterierna som ett slags protein "fabrik". Senare kommer vi att se att det har varit ett mycket relevant förfarande för utveckling av effektiva medicinska behandlingar..
När kulturen är klar och bakterierna har producerat stora mängder protein lyseras eller störs cellen. Det finns ett brett utbud av biokemiska tekniker som möjliggör rening av proteiner enligt deras fysikalisk-kemiska egenskaper..
I ett annat experimentellt sammanhang kanske vi inte är intresserade av att generera proteinet, utan snarare är vi intresserade av att erhålla DNA-sekvensen i sig. Om så var fallet skulle plasmiden användas för att skapa flera kopior av fragmentet av intresse för att ha tillräckligt med mål-DNA för att utföra relevanta experiment..
Rekombinant DNA-teknik öppnade ett oändligt antal möjligheter inom molekylärbiologi, bioteknik, medicin och andra relaterade områden. Dess mest framstående applikationer är följande.
Den första applikationen är direkt relaterad till molekylärbiologiska laboratorier. Rekombinant DNA-teknik gör det möjligt för forskare att förstå generens normala funktion, och de genererade proteinerna kan användas i vidare forskning..
Proteiner som produceras med hjälp av det rekombinanta DNA-förfarandet har tillämpningar inom medicin. Två mycket relevanta exempel på fältet är humant insulin och tillväxthormon, som appliceras på patienter som saknar detta protein..
Tack vare rekombinant DNA kan dessa proteiner genereras utan att behöva extrahera dem från en annan människa, vilket representerar ytterligare metodiska komplikationer och hälsorisker. Detta har bidragit till att förbättra livskvaliteten för otaliga patienter..
Ingen har kommenterat den här artikeln än.