De DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) Det är ett färgämne som, på grund av dess fluorescerande egenskap, tjänar som en markör och används ofta i bland annat fluorescensmikroskopi eller flödescytometriteknik. Fluorescensen som den avger är ljusblå, dess excitation sker mellan 455-461 nm (UV-ljus).
DAPI-färgämne kan passera genom cellmembranet i döda celler med stor lätthet. Det kan också fläcka kärnorna i levande celler, men i detta fall måste koncentrationen av detta vara högre.
Färgämnet kan komma åt cellulärt DNA för vilket det har en speciell affinitet och binder med stor avid till kvävebaserna adenin och tymin. Av denna anledning är det mycket användbart i vissa molekylärbiologiska tekniker..
Denna förening tillhör gruppen indolfärgämnen och har visat sig ha större känslighet för DNA än etidiumbromid och propidiumjodid, särskilt på agarosgeler..
Användningen av detta fluorescerande färgämne är mycket omfattande, eftersom det är användbart för: att studera förändringar i DNA i apoptotiska processer (celldöd) och därför detektera celler i denna process; för DNA-fotavtryck (DNA-fotoutskrift); att studera bakteriekontaminering; eller för att visualisera kärnkraftssegmentering.
Det har också använts i studien av kromosomala band, vid detektion av DNA från Mycoplasmas sp, i DNA-protein-interaktion, vid färgning och räkning av celler genom immunfluorescens och till och med för att färga mogna pollenkorn.
Artikelindex
DAPI är en förkortning för sitt kemiska namn (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol). Dess molekylformel är C16HfemtonN5. Den har en molekylvikt på 350,3. Nära UV-ljusområdet (345 till 358 nm) uppträder den maximala exciteringen av DAPI-DNA-komplexet, medan den maximala fluorescensemissionen sker mellan 455-461 nm..
Detta färgämne kännetecknas av att det är ett gult pulver, men strukturerna markerade med denna fluorofor avger ett ljusblått ljus..
Det är en förening löslig i vatten, men för att påskynda dess upplösning kan viss värme appliceras. Det kan spädas med PBS men inte direkt löst i det..
När färgen har beretts måste den förvaras i mörker, det vill säga skyddad från ljus, vid en temperatur av 2 till 8 ° C (kylskåp). Under dessa förhållanden är färgämnet stabilt i mer än 3 veckor eller månader..
Om den skyddas från ljus men lämnas vid rumstemperatur sjunker dess stabilitet till 2 eller 3 veckor, men utsätts för direkt ljus är försämringen väldigt snabb. Om du vill lagra mycket längre kan den kylas vid -20 ° C fördelat i alikvoter.
Denna färgning är baserad på att generera en nukleär motfärg i de viktigaste molekylära biologiteknikerna, såsom: flödescytometri, fluorescensmikroskopi och färgning av metafaskromosomer eller interfaskärnor, bland andra..
Denna teknik är baserad på den stora affiniteten som färgämnet har för de kvävebaser (adenin och tymin) som finns i det genetiska materialet (DNA) i det mindre spåret. Medan den ligger på den cytoplasmiska nivån, lämnar den väldigt liten bakgrund.
När det fluorescerande färgämnet binder till adenin- och tyminregionerna i DNA ökar fluorescensen betydligt (20 gånger mer). Färgen den avger är ljusblå. Speciellt finns det ingen fluorescensemission vid bindning till GC (guanin-cytosin) baspar.
Det är viktigt att notera att även om det också har en affinitet för RNA, orsakar detta inte något problem, eftersom den högsta graden av energiemission från denna molekyl förekommer vid en annan våglängd (500 nm), till skillnad från DNA, vilket gör det vid 460 nm . Dessutom är ökningen av fluorescens en gång kopplad till RNA endast 20%..
DAPI används mer för att fläcka döda (fixerade) celler än levande celler, eftersom en mycket högre koncentration av färgämnet behövs för att fläcka den senare, detta beror på att cellmembranet är mycket mindre permeabelt för DAPI när det lever.
DAPI-fläck kan användas i kombination med röda och gröna fluoroforer för en mångfärgad upplevelse.
DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) är en utmärkt fluorofor och används därför i stor utsträckning i olika tekniker och för olika ändamål. Användningen av DAPI i huvudteknikerna förklaras nedan.
Forskarna Gohde, Schumann och Zante 1978 var de första att använda och föreslå DAPI som en fluorofor i flödescytometritekniken, med stor framgång på grund av dess höga känslighet för DNA och dess höga intensitet i fluorescensemission..
Användningen av DAPI i denna teknik gör det möjligt att studera cellcykeln, kvantifiering av celler och färgning av levande och döda celler..
Även om det finns andra färgämnen, såsom etidiumbromid, Hoechstoxid, akridinorange och propidiumjodid, är DAPI en av de mest använda eftersom den är mer fotostabil än de som tidigare nämnts..
För denna teknik krävs det att fixera cellerna, för detta kan absolut etanol eller 4% paraformaldehyd användas. Provet centrifugeras och supernatanten kastas, därefter hydratiseras cellerna genom tillsats av 5 ml PBS-buffert i 15 minuter..
Medan tiden går förbereder DAPI-fläcken med en färgningsbuffert (FOXP3 från BioLegend) i en koncentration av 3 µM.
Centrifugera provet, kassera supernatanten och täck sedan med 1 ml DAPI-lösning i 15 minuter vid rumstemperatur..
Ta provet till flödescytometern med lämplig laser.
En annan teknik där DAPI används är i flödesmikro-fluorometri tillsammans med en annan fluorofor som kallas mitramycin. Båda är användbara för att kvantifiera kloroplast-DNA individuellt, men DAPI lämpar sig bäst för att mäta T4-bakteriofagpartiklar..
Denna teknik använder i princip DNA-sonder som är märkta med ett fluorescerande färgämne som kan vara DAPI..
Provet kräver värmebehandling för att denaturera dubbelsträngat DNA och omvandla det till två enkelsträngade strängar. Därefter hybridiseras den med en denaturerad DNA-sond märkt med DAPI som har en sekvens av intresse..
Senare tvättas den för att eliminera det som inte hybridiserade, en kontrast används för att visualisera DNA. Fluorescensmikroskopet möjliggör observation av den hybridiserade sonden.
Denna teknik har till syfte att detektera specifika sekvenser i det kromosomala DNA: t, att kunna diagnostisera vissa sjukdomar.
Dessa cytomolekylära tekniker har varit till stor hjälp för att bestämma detaljer i studien av karyotyper. Det har till exempel visat de regioner som är rika på adenosin- och tyminbaspar som heter heterokromatiska regioner eller DAPI-band..
Denna teknik används ofta för studier av kromosomer och kromatin hos växter och djur, samt för diagnos av prenatal och hematologisk patologi hos människor..
I denna teknik är den rekommenderade DAPI-koncentrationen 150 ng / ml under en tid av 15 minuter..
Monterade objektglas bör förvaras skyddade från ljus vid 2-8 ° C.
Celler fixeras med 4% paraformaldehyd. Om andra fläckar ska användas lämnas DAPI i slutet som en motfärg och cellerna täcks med PBS-lösning i 15 minuter. Medan tiden går förbereder du DAPI-lösningen genom att späda ut med PBS så att den slutliga koncentrationen är 300 µM.
Därefter avlägsnas överskottet av PBS och täcks med DAPI i 5 minuter. Det tvättas flera gånger. Objektglaset observeras i ett fluorescensmikroskop under lämpligt filter.
Denna förening måste hanteras med försiktighet, eftersom det är en förening som har mutagena egenskaper. Aktivt kol används för att eliminera denna förening från vattenlösningar som ska kasseras..
Handskar, klänning och skyddsglasögon måste användas för att undvika olyckor med detta reagens. Om hudkontakt eller slemhinna uppstår ska området tvättas med tillräckligt med vatten.
Du bör aldrig pipettera detta reagens genom munnen, använd pipetter.
Förorena inte reagenset med mikrobiella medel eftersom detta kan leda till felaktiga resultat.
Späd inte DAPI-fläcken mer än rekommenderat, eftersom detta kommer att minska färgningens kvalitet avsevärt..
Utsätt inte reagenset för direkt ljus eller håll det varmt eftersom det minskar fluorescensen.
Ingen har kommenterat den här artikeln än.