Koagulastestets motivering, procedur och användningsområden

1988
Jonah Lester
Koagulastestets motivering, procedur och användningsområden

De koagulastest det är en laboratorieteknik som används för att avslöja närvaron av koagulasenzymet. Detta enzym har egenskapen att koagulera plasma. Loeb 1903 var den första som beskrev detta enzym.

Detta test utförs på grampositiva kockar, katalaspositiva, vilket gör det möjligt att skilja stammarna av Staphylococcus aureus från resten av stafylokocker, eftersom det är den enda mikroorganismen av klinisk betydelse som producerar den.

Båda bilderna avslöjar ett positivt koagulastest. Källa: Vänster bild: Philippinjl [CC BY-SA 3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/)]. Höger bild: Foto taget av författaren MSc. Marielsa gil.

I denna mening kallas medlemmar av familjen Staphylococaceae som testar negativt ofta som koagulasnegativ Staphylococcus..

Det finns några olika stammar att S. aureus  som kan producera koagulas, såsom Staphylococcus schleiferi spp coagulans, S. hyicus, S. intermedius och S. delphini.

De tre första är dock av klinisk betydelse på veterinärnivå och kan mycket sällan hittas som ett orsakande medel för infektioner hos människor, medan S. delphini det finns bara i marina miljöer.

Dessutom är de lätt differentierade på grund av S. hyicus Y S. intermedius jäsa inte mannitol och S. schleiferi spp koagulaner fermenterar inte maltos eller trehalos medan S. aureus fermenterar dessa kolhydrater.

Närvaron av koagulasenzymet har kopplats till stammarnas virulens. Denna teori har emellertid fallit sönder, med tanke på att andra virulenta koagulasnegativa arter observeras som kan producera viktiga infektioner..

Artikelindex

  • 1 Motivering
  • 2 Förfarande
    • 2.1-Skjut koagulastest
    • 2.2-Rör-koagulastest
    • 2.3-Koagulastest med fibrinogen
  • 3 Använd
  • 4 Kvalitetskontroll
  • 5 Begränsningar
  • 6 Referenser

Grund

Staphylococcus aureus producerar två typer av koagulas, en som förblir fäst vid cellväggen, även kallad agglutinationsfaktor eller reaktiv koagulasfaktor (CRF), och en extracellulär som frigörs i flytande kulturer. Det är därför de kallas bundet koagulas respektive fritt koagulas..

Koagulasenzymet har sitt namn tack vare den verkan det producerar. Detta har förmågan att omvandla fibrinogen till fibrin, vilket skapar en tydlig koagel när den finns i plasma, det vill säga detta enzym simulerar trombins aktivitet i koagulationskaskaden.

Faktum är att en av de mest accepterade teorierna är att bundet koagulas reagerar med fritt koagulas för att aktivera koagulationsfaktorer. Denna aktivering genererar ett ämne som verkar på liknande sätt som protrombin gör, vilket skapar en förening med funktionen av trombin..

Skillnaden med den normala koagulationskaskaden är att denna reaktion inte kräver närvaro av kalcium och inte påverkas av heparin.

För att utföra koagulastestet är det tillräckligt att möta en ny kultur av Staphylococcus med en företrädesvis kaninplasma och därmed observera bildningen av koaglet eller inte.

Det finns specifika tekniker för att detektera bundet koagulas och bundet och fritt koagulas samtidigt..

Några stammar av S. aureus de ger ett positivt resultat snabbare än andra. Hastigheten för koagulationsbildning är direkt proportionell mot den närvarande koagulaskoncentrationen..

Bildkoagulastestet detekterar bundet koagulas och rörtestet detekterar både bundet och fritt koagulas.

Bearbeta

-Skjut koagulastest

Material

-Rengör bilden

-Kaninplasma kan företrädesvis humant eller hästplasma också användas. Plasma kan köpas frystorkat och rekonstitueras för användning, eller så kan det användas färskt (färskt). Ett annat genomförbart alternativ är användningen av fibrinogen.

-Steril saltlösning (0,85%) (SSF).

Få ny plasma

Rita venöst blod från människa eller djur. Något av följande antikoagulantia kan användas: EDTA, kalciumoxalat, heparin eller natriumcitrat. Blanda väl och centrifugera. Ta bort supernatanten (plasma) aseptiskt utan röda blodkroppar och placera den i ett sterilt rör.

Plasmaseparation. Källa: foto taget av författaren: MSc. Marielsa gil.

Lyofiliserad plasma

Rekonstituera enligt anvisningarna på injektionsflaskan med kommersiella kit.

Färskt fibrinogen

Använd citratplasma och blanda plasman i lika delar med en mättad natriumkloridlösning. Låt fälla ut och centrifugera.

Kassera supernatanten, rekonstituera fällningen upp till 5 gånger volymen med sterilt destillerat vatten. Tillsätt 5 enheter heparin för varje ml fibrinogen. Förvara i ett sterilt rör.

Metod

En droppe saltlösning och en droppe plasma placeras separat på ett objektglas. Ta med platinslingan 1 eller 2 rena kolonier av mikroorganismen som ska testas.

Blanda bakteriebelastningen i plasmadroppen och upprepa operationen på SSF-droppen. Observera resultaten omedelbart. Ett positivt resultat kommer att vara ett där bildandet av ett makroskopiskt agglutinat (vit fällning) observeras efter en minut på sidan av droppen med plasma.

SSF-droppen fungerar som en negativ kontroll. Om agglutination observeras med SSF betyder detta att mikroorganismen självagglutinerar, vilket kan ge falskt positiva resultat. I detta fall måste det bekräftas med rörtestet.

Det rekommenderas också att montera en positiv kontroll med en känd stam av S. aureus.   

Tolkning

Agglutination inom 5-20 sek (starkt positivt test).

Variabel agglutination som inträffar mellan 20 sekunder och en minut (fördröjt positivt test).

En viss grad av agglutination efter en minut (tveksamt bevis). Det rekommenderas att upprepa testet eller bekräfta med rörmetoden.

Ingen agglutination (negativt test).

Resultat med SSF. Det måste alltid ge negativt, om det automatiskt ger positivt, blir testresultatet ogiltigt.

-Rörkoagulastest

Material

-Sterilt provrör

-Plasma

-Vattenbad vid 37 ° C.

Metod

Pipettera 0,5 ml plasma i ett 12 x 75 provrör med en steril pipett. Ladda platinslingan med 2 till 4 rena kolonier för att studera från en fast odling i 18 till 24 timmar och lös upp i plasma och blanda försiktigt och inkubera vid 37 ° C i 4 timmar.

Undersök röret under den första timmen utan att skaka det, bara luta det försiktigt. Om en blodpropp fortfarande inte ses kan den observeras var 30: e minut tills de fyra timmarna är klara. Om det fortfarande är negativt efter 4 timmar kan det stå i upp till 24 timmar men vid rumstemperatur. Observera och rapportera resultatet.

Baserat på erfarenhet rekommenderar vissa mikrobiologer att använda 500 µl av en bakteriesuspension från en 18-timmarsodling i flytande medium för att utföra testet..

Det verkar ge snabbare och mer tillförlitliga resultat än vid emulgering av kolonier från fasta medier, särskilt om human plasma som erhållits från blodbanken har använts..

Användningen av stammar från en buljong hjälper till att späda ut den möjliga närvaron av humana antistylokockantikroppar i plasma som kan hämma koagulasverkan..

Tolkning

Om en blodpropp ses som omfattar hela vätskan (fullständig koagulering) eller koagulerar med ingenting i den återstående vätskan (partiell koagulering) bör det betraktas som ett positivt test..

Om ingen koagel bildas, dvs suspensionen förblir homogen, testet är negativt.

-Koagulastest med fibrinogen

Fibrinogen används på samma sätt som plasma och används för både bild- och rörtester. Fortsätt enligt beskrivningen för plasma och tolk på samma sätt.

Använda sig av

Den används för att differentiera Staphylococcus aureus av koagulasnegativa stafylokocker.

QA

Ha färska kulturer av en stam av S. aureus att användas som en positiv kontroll. En stam av S. epidermidis som negativ kontroll.

Begränsningar

-Ett positivt test bör inte lämnas i inkubation i 24 timmar, eftersom S. aureus producerar ett fibrinolysin som löser blodproppen.

-För ett tillförlitligt test bör färsk eller nyligen rekonstituerad plasma användas, liksom det är viktigt att använda färska bakteriekulturer (18 till 24 timmar). Detta undviker falska negativ.

-Testet måste utföras i samband med en negativ och en positiv kontroll.

-Vissa fasta medier kan störa koagulastestet. Det rekommenderas inte att använda kolonier från salt mannitolagar.

-Om citratplasma används rekommenderas att placera 5 enheter heparin per ml plasma för att undvika falska positiva effekter. Detta beror på att andra mikroorganismer än S. aureus de kan bryta ner citrat och få plasma att koagulera. I det här fallet är det lämpligt att göra ett Gram- och ett katalastest..

-Det är viktigt att i rörtestet övervaka reaktionen var 30: e minut, eftersom det finns stammar av S. aureus De producerar höga koncentrationer av fibrinolysin och kommer att späda ut den nybildade koageln snabbt. Undvik falska negativ.

-Undvik att skaka röret kraftigt när du övervakar testet, detta kan förstöra initieringen av koagelbildning som inte kommer att återställas senare och orsaka falska negativ.

Referenser

  1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnos. 5: e upplagan Redaktionellt Panamericana S.A. Argentina.
  2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologisk diagnos. 12 utgåva Redaktionellt Panamericana S.A. Argentina.
  3. Mac Faddin J. (2003). Biokemiska tester för identifiering av bakterier av klinisk betydelse. 3: e upplagan Ledare Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
  4. Pro-Lab-laboratorier. Kanin koagulerar plasma. Finns på: pro-lab.com
  5. "Koagulas." Wikipedia, den fria encyklopedin. 12 feb 2019, 04:23 UTC. 22 apr 2019, 15:50 wikipedia.org.

Ingen har kommenterat den här artikeln än.